Конфокальная микроскопия. Принцип действия, примеры исследования

Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.

Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача - исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса).

Глоссарий:

FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул.

FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате резонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.

Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy - Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.

Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto- Optic Tunable Filter (AOTF) - Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.

Полосовой фильтр - Bandpass Filter - фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (английская аббревиатура CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.

Светоделитель - Beamsplitter - Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.

Холодное зеркало - Cold Mirror - Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.

Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) - Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 45 градусов к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 90 градусов на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.

Скат фильтра - Filter Slope - Скат оптического фильтра - это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизну характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.

Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) - Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).

Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon- Intensifier Target (ISIT) Camera - Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT - трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ ) - Near- Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) - Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.

В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r A = XY =0,6 λ/NA,

где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY c r =0,4 λ/NA,

где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z r =2 λ/NA 2 ,

где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.

Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия - метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК - оранжевое.

Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.

Ультрафиолетовая микроскопия - метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура - электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

Электронная микроскопия . В электронных микроскопах используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до 1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток.

Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производится количественное определения его содержания в клетке.

Радиоавтография - важный информативный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин - в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Гисто- и иммуноцитохимические методы . В их основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др. Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек - тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). Если меченые антитела нанести на гистологический срез, они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе. Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. Модификацией рассматриваемого метода является введение меченых антител в цитоплазму живых клеток с помощью микроманипуляторов.

Метод культуры клеток , тканей заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах (в условиях in vitro). Для получения изолированных клеток производят предварительную обработку материала ферментами трипсином или коллагеназой. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели. Особенно важное значение данный метод имеет для эмбриологических и цитофизиологических исследований, а также для трансплантации эмбриональных клеток при лечении врожденных и приобретенных дефектов обмена веществ.

Микроскопическая хирургия клетки - совокупность методических приемов, осуществляемых с помощью специального прибора - микроманипулятора. Этот прибор позволяет производить различного рода тончайшие операции на клетке (введение веществ, удаление или пересадка структурных компонентов клетки, нанесение уколов, разрезов и пр.) и нашел широкое применение в эмбриологии.

Цейтрафферная, или замедленная , микрокино- или видеосъемка - изучение живых клеток. Такой способ позволяет проследить за медленно протекающими изменениями клеток.

Метод фракционирования (дифференциального центрифугирования) клеток. Его суть заключается в получении из клеток изолированных структурных компонентов. Основан на разных скоростях осаждения этих компонентов при вращении гомогенатов клеток в ультрацентрифугах. Данный метод сыграл и играет очень важную роль в изучении химического состава и функциональных свойств субклеточных элементов - прежде всего, органелл.

Конфокальная микроскопия - современный метод, использующий в качестве осветителя лазерный луч, который последовательно сканирует всю толщину препарата. Информация о плотности объекта по каждой линии сканирования передается в компьютер, где специальная программа осуществляет трехмерную реконструкцию исследуемого объекта.

Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

Конфокальную флуоресцентную микроскопию можно рассматривать как разновидность традиционной флуоресцентной микроскопии, которая позволяет исследовать внутреннюю микроструктуру клеток, причем не только фиксированных, но и живых, идентифицировать микроорганизмы, структуры клетки и отдельные молекулы, наблюдать динамические процессы в клетках. Конфокальная флуоресцентная микроскопия в дополнение к этому обеспечила возможность трехмерного субмикронного разрешения объекта и существенно расширила возможность неразрушающего анализа прозрачных образцов. Повышение разрешающей способности достигается благодаря использованию в конфокальных микроскопах лазеров в качестве источников света и конфокальной диафрагмы для фильтрации внефокусной флуоресценции. Преимущество лазеров по сравнению с ртутными или ксеноновыми лампами заключается в монохроматичности и высокой параллельности испускаемого пучка света. Эти свойства лазерного излучения обеспечивают более эффективную работу оптической системы микроскопа, уменьшают число бликов, улучшают точность фокусировки пучка света. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Конечно, при этом лазерный луч возбуждает флуоресценцию как в точке фокуса, так и во всех слоях образца, через которые проходит. И если эта внефокусная флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива, это ухудшает разрешение оптической системы. Избавиться от внефокусной флуоресценции позволяет конфокальная диафрагма. Изменяя диаметр конфокальной диафрагмы, можно определять толщину оптического слоя вблизи фокуса лазерного луча, поэтому флуоресценция, испускаемая выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и не регистрируется. Благодаря этому конфокальная микроскопия обеспечивает улучшенное разрешение, в первую очередь вдоль оси Z.

Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.

Благодаря улучшенному разрешению, особенно повышенному разрешению по оси Z, и возможности создавать серии «оптических» срезов, конфокальный микроскоп позволяет исследовать тонкую структуру объекта в трехмерном пространстве. Специальные программы позволяют создать из серии оптических срезов объемное изображение объекта (3D) и как бы рассматривать его под разными углами зрения, что может дать ценную информацию о форме клеток, цитоскелете, структуре ядра, хромосомах и даже локализации в них отдельных генов, а так же о взаиморасположении этих элементов.

Использование мультиспектрального (с несколькими флуорохромами) режима работы лазерного сканирующего конфокального микроскопа позволяет исследовать колоколизацию (пространственное взаиморасположение) в клетке двух или более разных веществ, например, белков, помеченных разными флуоресцентными красителями. Исследуя такие препараты в обычном флуоресцентном микроскопе, нельзя с уверенностью утверждать, находятся эти вещества рядом или одно под другим. С помощью метода оптических срезов и дальнейшей 3D-реконструкции объекта можно воссоздать объемное распределение веществ. Мультиспектральный режим так же позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования методом FISH.

Анализ интенсивности и формы спектров собственной флуоресценции позволяет распознавать нормальные и воспаленные клетки, и такой метод, в частности, предложен в качестве нового способа ранней диагностики шейки матки.

Подобрав комбинацию фильтров для нескольких типов собственной флуоресценции, возможно без проведения гистохимического окрашивания и трудоемкого получения и исследования множества срезов различать злокачественные и нормальные тканевые структуры в биопсийных пробах лимфоузлов пациентов с лимфоаденопатией различного происхождения.

Методы конфокальной микроскопии широко применяются в эмбриологии и гидробиологии, ботанике, зоологии при изучении структуры гамет, развития и формирования организмов.

Основные понятия

Хотя современные приборы значительно отличаются от самых ранних версий, принцип конфокального получения изображений, выдвинутый Марвином Мински и запатентованный в 1957 году, применяется во всех современных конфокальных микроскопах. В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство регистрации изображения или фотопленку. Метод же формирования изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение осуществляется сканированием всей поверхности образца одним или более сфокусированным лучом света, обычно от лазерного дугового источника. Освещенная область образца фокусируется объективом и затем сканируется с помощью сканирующего устройства с управлением через компьютер. Последовательность световых лучей от образца распознается через точечную диафрагму (или, в некоторых случаях, щелевую диафрагму) фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), выходные сигналы которого преобразуются в изображение, отображаемое на компьютере. Хотя неокрашенные образцы и можно наблюдать с помощью отраженного от них света, их обычно отмечают одной или более флуоресцентными красителями.

Способы получения изображения

При конфокальной микроскопии для исследования огромного количества образцов разного типа используются различные методы получения изображения. Все они основываются на технической возможности получения изображений высокой четкости, называемых оптическими срезами, в последовательности относительно толстых срезов или всего образца целиком (тотального препарата). Оптический срез является базовым элементом изображения. Сами изображения получаются при наблюдении связанных и окрашенных образцов в режимах одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения, формируемые с помощью различных методик освещения и окрашивания, будут точно соотнесены между собой. Возможно получение изображений живой клетки и развернутой во времени последовательности изображений (регистрация изображений в заданный временной интервал), а численные методы обработки, применяемые к последовательностям изображений, позволяют создать интегрированное целое изображение из серии изображений по оси z и трехмерные изображения образцов., а также представление трехмерных данных во временной последовательности, то есть четырехмерное изображение. В первых конфокальных микроскопах изображения получались с помощью отраженного света, но, в действительности, в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе может быть применен способ получения изображения с помощью любого источника проходящего света, обычно используемого в микроскопии.

Создание изображения

Процедуры подготовки образца и получения его изображения с помощью конфокальных микроскопов - это, в основном, те, которые были разработаны в течении многих лет в традиционной широкопольной микроскопии. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно окрашиваются одной или более флуоресцентными метками. Существует большое количество различных флуоресцентных красителей, которые могут быть занесены в относительно простые протоколы и использоваться для окрашивания определенных клеточных органелл и структур. Среди огромного множества доступных красителей имеются, например, красители ядра, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума, митохондрий, а также такие красители, как флуоресцирующий фаллоидин, указывающий на полимеризированный актин в клетках. Независимо от применяемого способа подготовки образца, главное преимущество конфокальной микроскопии заключается в гибкости способов представления и анализа изображения, являющейся следствием одновременного сбора множественных изображений и их представления в компьютере в цифровой форме.

Критические аспекты конфокальной микроскопии

Получение количественных трехмерных изображений во флуоресцентной микроскопии часто осложнено артефактами, возникающими при подготовке образца, благодаря контролируемым и неконтролируемым экспериментальным величинам или проблемам расположения и компоновки микроскопа. Эта статья, написанная доктором Джеймсом Б. Поли, систематизирует наиболее общие внешние факторы, которые часто «заслоняют» результаты, полученные в широкопольной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Среди обсуждаемых тем - лазерная система, юстировка оптических компонентов, увеличение объективов, артефакты, связанные с обесцвечиванием, аберрации, иммерсионное масло, толщина покровного стекла, квантовый выход (квантовая эффективность), и среда образца.

Аберрации в многоцветной конфокальной микроскопии

Усовершенствования конструкции упростили конфокальную микроскопию до такой степени, что она стала обычным инструментом проведения исследований в клеточной биологии. Но поскольку конфокальные микроскопы стали мощнее, стали предъявляться более высокие требования к их оптике. На самом деле, оптические аберрации вызывающие незначительные дефекты изображения в широкопольной микроскопии, могут привести к разрушительным последствиям в конфокальной микроскопии. К сожалению, строгие оптические требования в конфокальной микроскопии часто скрыты из-за оптических систем, гарантирующих четкое изображение даже в случае слабого микроскопа. Производители оптики выпускают множество различных объективов для микроскопов, предназначенных для определенных приложений. В этой статье показывается, какое влияние компромиссные решения при создании объективов оказывают на конфокальную микроскопию.

Трехцветная визуализация в конфокальной микроскопии

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) обычно используется для получения цифровых изображений флуоресцентных образцов, помеченных одной, двумя и тремя метками. Использование красного, зеленого и синего (RGB) цветов наиболее информативно для представления распределения света до трех флуоресцирующих меток клетки, когда для каждого взаимного расположения используется дополнительный цвет и когда изображения разного цвета образуют единую трехцветную картину. В этом разделе мы рассмотрим упрощенную версию недавно опубликованного метода получения трехцветных конфокальных изображений с помощью популярной программы обработки изображений, Adobe Photoshop. В дополнение, обсуждаются несколько приложений по созданию протокола трехцветного изображения для представления конфокальных снимков. Стоит иметь в виду, что эти численные методы не ограничиваются изображениями, полученными ЛСКМ, и могут применяться к цифровым изображениям, импортированным в Photoshop из других источников.

Основы конфокальной отражательной микроскопии

Конфокальная отражательная микроскопия может быть применяться для получения, дополнительной информации об образце, с относительно незначительными дополнительными усилиями, поскольку методики требуют минимальной подготовки образца и перенастройки оборудования. К тому же, в конфокальной отражательной микроскопии информация о неокрашенных тканях также легко доступна, как и данные, получаемые при работе с окрашенными образцами, отражающими свет. Этот метод можно также комбинировать с более распространенными методами исследований в свете флуоресценции. Примерами недавних приложений являются регистрация неокрашенных клеток в популяции флуоресцентно окрашенных клеток и наблюдение взаимодействий между флуоресцентно окрашенными клетками, растущими на непрозрачном структурированном субстрате.

Галерея конфокальных изображений

Галерея конфокальных снимков Nikon MicroscopyU представляет собой последовательность цифровых изображений, полученных с использованием конфокального микроскопа Nikon PCM-2000, объединенного с прямым микроскопом Eclipse E-600. Последовательность изображений оптических срезов в различных плоскостях образца была получена при сканировании вдоль оптической оси микроскопа. Последовательность представлена интерактивным Java - приложением, позволяющим либо «проигрывать» серию срезов автоматически, либо прокручивать их вперед и назад, как слайды.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

Было разработано несколько методов для преодоления явления плохого контраста, присущего изображениям образцов с большой толщиной, обычно создаваемым микроскопами. Конфокальная и деконволюционная методики создают существенно лучшие изображения образцов средней толщины (от 5 до 15 микрон). Изображения образцов с наибольшей толщиной (от 20 микрон и более) ухудшаются из-за воздействия большого потока внешнего света от внефокусных областей и, возможно, лучше всего получаются методами конфокальной микроскопии. С помощью этого учебного руководства образцы представлены сериями оптических срезов вдоль оси z с помощью виртуального конфокального микроскопа.

Отражательная конфокальная микроскопия

С помощью этого учебного руководства можно исследовать отдельные слои поверхности интегральных микросхем. Цифровые изображения для руководства были получены с помощью отражательного конфокального микроскопа Nikon Optiphot C200. Для каждой серии была записана последовательность оптических срезов по оси z, по мере проникновения и фокусировки микроскопа вглубь (с шагом 1 микрометр) мозаики схем на поверхности кремниевого кристалла.

Основные положения

По сравнению с традиционной, конфокальная микроскопия имеет несколько преимуществ, включая малую глубину проникновения в исследуемый образец, отсутствие фоновых засветок и возможность получать серии оптических срезов образцов большой толщины. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно отмечены одной или более флуоресцентными метками.

Рис. 1. Схема хода лучей в конфокальной микроскопии

При получении изображений флуоресцирующих образцов с помощью традиционного широкопольного микроскопа вторичное свечение, испускаемое образцом из областей вне исследования, часто влияет на четкость изображения деталей, находящихся в фокусе. Это особенно проблематично при толщине образцов более 2-х микрометров. Конфокальная микроскопия дает незначительное улучшение разрешения как вдоль оси, так и по плоскости; но именно возможность исключить фоновые засветки, возникающие во флуоресцентно-окрашенных образцах большой толщины, вызвала недавний всплеск популярности этого метода исследования. Будучи относительно простыми в управлении, большинство современных конфокальных микроскопов, стали частью базового оборудования во многих многопользовательских системах по работе с изображениями. Поскольку разрешение, достигаемое лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (ЛСКМ) несколько лучше традиционного широкопольного оптического микроскопа, но все же значительно ниже разрешения просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, он, в определенном смысле, явился мостом между двумя наиболее распространенными методами исследований. На рисунке 1 представлена принципиальная схема прохождения света в конфокальном микроскопе базовой компоновки.

В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство визуализации изображения или фотопленку. Метод же получения изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение образца осуществляется сканированием его одним или более сфокусированным лучом, обычно лазерным (рисунок 2). Изображения, получаемые сканированием образца, таким образом, называются оптическими срезами. Эта терминология относится к неинвазивному методу исследований, когда изображения получаются с помощью сфокусированного света, а не физическим рассечением образца.

Рис. 2. Широкопольное и точечное сканирование образцов

Конфокальная микроскопия значительно упростила исследование живых образцов, сделала возможным получение данных в трех измерениях (z-серия) и более совершенным процесс получения изображений мультиокрашенных образцов. На рисунке 3 сравнивается традиционное изображение, полученное при исследовании в свете флуоресценции с эпископическим осветителем с конфокальным изображением, одних и тех же участков тотального препарата куколки бабочки с эпителием, окрашенным иодидом пропидия. Очевидно впечатляющее повышение разрешающей способности и, как следствие, резкости изображения ядер на снимке ЛСКМ, благодаря исключению внефокусного флуоресцентного свечения.

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ)

ЛСКМ - сейчас наиболее распространенная версия конфокальных микроскопов, применяемых в биомедицине. Во введении особое внимание уделяется именно ЛСКМ, поскольку конструкция и устройство эти микроскопов позволяет работать с ними даже начинающим пользователям. Другие конструктивные решения заняли свои специальные ниши в биологии. Для любой модели Или модификации конфокального микроскопа применимо, с незначительными изменениями, большинство правил подготовки образцов, также как и для других методик, основанных на оптических срезах, таких как деконволюционная и многофотонная методики.

Развитие конфокальной микроскопии

Считается, что изобретение конфокального микроскопа принадлежит Марвину Мински, который создал рабочий микроскоп в 1955 году. Развитие конфокальной микроскопии было во многом вызвано желанием наблюдать биологические процессы в живой ткани (in vivo) (в организме), и Мински ставил перед собой цель получить изображение нейронной сети в неокрашенном препарате живого мозга. Принципы конфокальной микроскопии, выдвинутые Мински и запатентованные в 1957 году, применяются во всех современных конфокальных микроскопах. На рисунке 1 поясняется конфокальный принцип, в применении к эпифлуоресцентной микроскопии, положенный в основу всех современных конфокальных систем, используемых при получении флуоресцентных изображений. В первоначальной конфигурации Мински использовал точечное отверстие (диафрагму), помещенную напротив циркониевого дугового источника света, используемого в качестве точечного источника света.

Рис. 3. Эпителий крыла бабочки

Свет от точечного источника фокусировался в виде точки объективом на заданной фокальной плоскости в образце и, проходя через него, фокусировался вторым объективом на второй точечной диафрагме (точечном отверстии), находящейся в фокусе с первой (они являлись софокусными, т. е. конфокальными). Лучи, проходящие через второе точечное отверстие, попадали на фотоумножитель с низким уровнем шума, генерирующий сигнал в зависимости от яркости света, исходящего от образца. Второе точечное отверстие отсекало от фотоумножителя свет, идущий из областей выше или ниже фокальной плоскости в образце. Использование пространственной фильтрации для исключения внефокусного света и засветок при работе с образцами толще фокальной плоскости является ключевым принципом конфокальной микроскопии. В своих работах Мински также описывал отражательный микроскоп с одним объективом и дихроматическим зеркалом, конструкция которого стала основой используемых сейчас систем.

Чтобы получить изображение конфокальным методом, необходимо выполнить сканирование образца сфокусированным в точку светом. В оригинальном приборе, собранном Мински, луч света был неподвижен, а сам образец двигался на вибрирующем предметном столике. Неподвижность сканирующего луча относительно оптической оси микроскопа являлась преимуществом этой установки, так как это позволяла исключить большинство дефектов оптики, которые могли бы исказить изображение. Однако, при исследования биологических образцов это могло вызывать колебания и дисторсию, в конечном итоге, приводило к потере разрешающей способности и четкости изображения. Более того, при перемещении предметного столика и образца, невозможно выполнить никаких манипуляций, таких как, например, микроинъекции флуоресцентно окрашенных клеток.

Но, независимо от способа сканирования образца, необходимо получить его изображение. А первоначальная схема Мински не создавала действительного изображения, так как выходной сигнал фотоумножителя подавался на использовавшийся в вооруженных силах осциллограф с длительным послесвечением, не имеющий записывающего устройства. Позже Мински писал, что не слишком впечатляющее качество его изображения было следствием не низкой разрешающей способности самого микроскопа, но дисплея осциллографа. Сейчас понятно, что из-за отсутствия технологий Мински не мог в полной мере продемонстрировать весь потенциал конфокального метода, особенно при визуализации биологических структур. Он указывал, что быть может именно это стало причиной того, что конфокальная микроскопия не сразу была воспринята весьма требовательным сообществом биологов, для которых всегда было приоритетно качество получаемых изображений. В то время в их распоряжении были световые микроскопы с превосходной оптикой, позволяющие наблюдать и фотографировать цветные яркоокрашенные гистологические срезы на высокочувствительную цветную пленку. В современных конфокальных микроскопах изображение формируется из сигналов, поступающих с фотоумножителя или улавливаемых цифровой камерой со встроенным прибором с зарядовой связью, непосредственно обрабатывается компьютерной системой работы с изображениями, выводится на экран с высоким разрешением и на устройство документирования изображений превосходного качества. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа приведена на рисунке 4.

Рис. 4. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа

Эти технологии развивались независимо, и с 1955 года постепенно встраивались в конфокальные системы визуализации. Например, методы обработки цифрового изображения впервые были успешно применены в начале 80-х исследователями океанографического института Вудз Хоул (Woods Hole Oceanographic Institute). Используя, в их терминологии, «видео-микроскопы», они смогли получить изображения клеточной структуры микротрубок, размером меньше теоретического предела разрешающей способности оптического микроскопа. Очевидный рост разрешения стал возможен благодаря цифровой оптимизации изображений, захватываемых высокочувствительной суперкремниконовой (SIT) видеокамерой, соединенной с цифровым процессором изображений. Клеточные структуры были визуализованы с помощью оптики, работающей на дифференциальном интерференционном контрасте (ДИК), и дальнейшей обработки изображений цифровыми методами.

Классификация конструкций конфокальных микроскопов обычно основывается на методе сканирования образца. Существует два основных способа сканирования: сканирование предметного столика и сканирование осветительного луча; и, по крайней мере, два способа сканирования луча. В основу первоначального прибора Мински была положена система сканирования предметного столика, приводимая в движение примитивным камертонным генератором, которая создавала изображение довольно медленно. Современные конфокальные установки со сканированием предметного столика, ушедшие далеко вперед от своих прототипов, используются, в основном, в материаловедении, например, в производстве микрокристаллов. Системы, основанные на этом принципе, стали в последнее время популярны в областях биомедицины, где проводится анализ ДНК на микрокристаллах.

Более практичной альтернативой формирования изображений биологических систем является сканирование стационарного образца лучом. Этот принцип лежит в основе многих измерительных систем, усовершенствование которых привело к появлению популярных сегодня исследовательских микроскопов. В данном введении мы не касаемся технических деталей конфокальной микроскопии, но, по существу, в ней используются два принципиально отличных метода сканирования луча: многолучевое сканирование и однолучевое сканирование. Однолучевое сканирование на сегодня наиболее распространено, и именно этот метод применяется в ЛСКМ. Здесь сканирование луча производится с помощью управляемых компьютером зеркал, приводимых в движение гальванометрами со скоростью один кадр в секунду. Для достижения более быстрого сканирования, приблизительно с частотой видео кадров, в некоторых системах применяется акустооптическое устройство или колеблющиеся зеркала. В альтернативном методе используют два луча для сканирования почти в реальном времени, при этом обычно применяется разновидность вращающегося диска Нипкова. Эти системы явились результатом модификации и доводки спаренных (тандемных) сканирующих микроскопов (TSM), с целью создания более эффективных моделей для создания изображений флуоресцентно-окрашенных образцов. На рисунке 5 показана такая усовершенствованная система со спаренными дисками Нипкова и микролинзами для повышения чувствительности к слабому флуоресцентному свечению при создании изображения в реальном времени.

Рис. 5. Оптическая схема на основе дисков Нипкова

На сегодняшний день в конфокальной микроскопии существуют два альтернативных метода получения оптических срезов: метод деконволюции и многофотонный. Они различаются технически, но, как и конфокальные методы, основываются на традиционной оптической микроскопии. Деконволюция основана на вычислительных алгоритмах расчета и удаления той информации, которая поступает при создании изображения из внефокусных областей. Эта методика стала весьма удобной благодаря эффективным алгоритмам и высокопроизводительным миникомпьютерам. Многофотонная микроскопия использует ту же сканирующую систему, что и ЛСКМ, но не требует наличия точечной диафрагмы в приемнике. В ней нет необходимости, так как лазер возбуждает флуорохромную метку только в точке фокуса, исключая тем самым внефокусное излучение. При наблюдении живых тканей у этого способа появляются дополнительные преимущества, а именно: снижение фотообесцвечивания, поскольку уменьшается количество энергии, передаваемой лазерным лучом и поглощаемой тканями образца.

Традиционный оптический микроскоп представляет собой базу, на которой строится ЛСКМ. Вместо вольфрамовой или ртутной лампы применяется лазер, который связан с чувствительным фотоумножителем (ФЭУ) и компьютером, управляющим сканирующими зеркалами и другими сканирующими устройствами, а также облегчающим сбор и представление изображений. Полученные данные хранятся на цифровых носителях и могут быть обработаны с помощью многочисленных пакетов программ, либо на компьютере самой системы, либо на каком-нибудь другом.

По конструкции ЛСКМ, освещение и прием (регистрация) сигнала ограничиваются точкой на образце с дифракционным пределом. Объективы микроскопа сводят пятно освещения в фокус, и сканирующее устройство выполняет сканирование образца этим пятном под управлением компьютера. Сигналы от светящихся точек образца попадают в фотоумножитель через точечную (или, в некоторых случаях, щелевую) диафрагму, а выходные сигналы ФЭУ формируются в изображение и визуально воспроизводятся компьютером. Хотя неокрашенные образцы можно наблюдать в отраженном от образца свете, обычно они окрашиваются одной или более флуоресцентными красителями. Один из наиболее распространенных ЛСКМ, описанный в литературе примерно в 1990 году, был разработан в ответ на фундаментальную проблему, с которой столкнулись биологии-исследователи. Многие структуры и отдельные макромолекулы внутри иммунофлуоресцентно окрашенных зародышей невозможно визуализировать традиционным эпифлуоресцентным микроскопом после двухклеточной стадии, поскольку при возрастании числа клеток объем эмбриона остается примерно таким же. Это означает, что при более плотном расположении клеток усиливается свечение от клеток вне фокальной плоскости, что приводит к ухудшению разрешения изображения.

Рис. 6. Конфигурация лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon

Группа исследователей, работающих над этой проблемой, обнаружила, что ни одна из доступных в то время конфокальных систем не отвечает их требованиям. На то время микроскопы со сканированием предметного столика работали слишком медленно. На создание одного изображения уходило примерно 10 секунд, а приборы с многолучевым сканированием еще не подходили для флуоресцентной визуализации с практической точки зрения. ЛСКМ был разработан таким образом, чтобы удовлетворять требованиям традиционной эпифлуоресцентной микроскопии и, наряду с другими, разрабатываемыми в то же время, стал прообразом сложных систем, предлагаемых сейчас биомедицинскому сообществу различными фирмами. Пример применяемой сегодня системы (Nikon E1000) приведен на рисунке 6.

В специально разработанных приборах толщина оптических срезов может меняться с изменением диаметра точечного отверстия перед фотоприемником. В сравнении с другими конструкциями с фиксированным размером точечного отверстия эта дополнительная функция оказывается чрезвычайно гибкой при визуализации биологических структур. Изображение может быть увеличено без потери разрешения за счет сокращения сканируемой площади образца и помещения отсканированной информации в массив данных того же размера для хранения и визуального представления (подобным образом меняется увеличение и в сканирующем электронном микроскопе). Благодаря этому у одного объектива появляется интервал изменения масштаба, что может быть чрезвычайно полезным при визуализации редких или скоротечных событий, которые могут быть пропущены или потеряны при смене объектива.

Благодаря детально проработанным и гибким возможностям ЛСКМ, предлагаемых сейчас коммерческими фирмами по приемлемым ценам, в последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, когда многие многопользовательские лаборатории предпочитают это оборудование электронным микроскопам. Преимуществом конфокальной микроскопии является относительная легкость, с которой могут быть получены высококачественные изображения образцов, приготовленных для традиционной оптической микроскопии, и большое число приложений в различных областях исследований.

Первое поколение ЛСКМ хорошо работало с зафиксированными образцами, но им не удавалось контролировать световую энергию лазеров, что слишком часто приводило к фатальному разрушению живого образца, если не предпринимались серьезные меры предосторожности. Несмотря на эти ограничения, изображения зафиксированных образцов были настолько качественными, что конфокальный подход был безоговорочно принят специалистами. В приборах последующих поколений был усовершенствован каждый аспект процесса визуализации. В дополнение к этому, новые приборы стали значительно эргономичней и удобней в работе, так что юстировка, смена комбинации фильтров, регулировка мощности лазера, производимые с помощью компьютера, стали гораздо легче и быстрее. Сейчас возможно снимать изображения с тремя флуорохромами одновременно, а последовательно - с еще большим числом. Благодаря усовершенствованному и более надежному программному обеспечению, повышению быстродействия компьютеров, увеличению емкости дисков и падению цен на оперативные запоминающие устройства, процесс обработки изображения тоже значительно продвинулся вперед.

Режимы формирования изображения

Основным применением конфокального микроскопа является получение изображений толстых образцов различного типа. Преимущество конфокального метода проистекает из возможности создавать изображения образца как последовательность отдельных оптических срезов высокой четкости и разрешения. При этом используется несколько режимов визуализации; в основе каждого из них лежит оптический срез, как базовая единица изображения.

Рис. 1. Оптические срезы, меченные тремя метками

Отдельные оптические срезы

Оптический срез является базовой единицей изображения в методах конфокальной микроскопии. Могут быть получены изображения связанных и окрашенных образцов в режиме одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения мультиокрашенных образцов, будут совмещены друг с другом (если используются объективы с адекватной коррекцией хроматической аберрации). Дополнительное совмещение обычно производится методами цифровой обработки изображения. Большинству лазерных сканирующих конфокальных микроскопов (ЛСКМ) требуется примерно 1 секунда на получение оптического среза, хотя, обычно, изображения нескольких оптических срезов усредняются для улучшения отношения сигнал - шум. Время получения изображения, конечно, зависит от размеров изображения в пикселях и быстродействия компьютера системы. Для хранения типичного 8-битного изображения размером 768×512 пикселей потребуется около 0.3 Мбит памяти.

Представленные на рисунке 1 оптические срезы получены одновременно при облучении возбуждающим светом трех различных длин волн (488, 568 и 647 нанометров) при использовании одного криптонового / аргонового лазера в качестве источника излучения. В качестве образца представлен имагинальный диск крыла дрозофилы на третьей возрастной стадии, в котором помечены три гена, участвующих в формировании крыла. Три представленных гена и соответствующие флуорохромные метки таковы: (a) рудиментарный (флюоресцеин - 496 нанометров); (b) бескрылый (лиссамин родамин - 572 нанометров); и © CiD (цианин 5 - 649 нанометров). Комбинированное изображение трех пространственно представленных доменов генов, формирующих крыло, располагается внизу справа (изображение (d)).

Съемка в заданный временной интервал и визуализация живой клетки

Исследования живых клеток в заданный временной интервал приобрело новый импульс благодаря повышению разрешающей способности ЛСКМ. Ранее исследования движений клеточных структур проводились с использованием 16-миллиметровой фотопленки и интервалометром с часовым механизмом, соединенным с фотокамерой, позже с помощью видеомагнитофона с функцией цейтраферной съемки, оптического устройства записи на диск или платой оцифровки видеоизображений. Сейчас с помощью ЛСКМ можно получать оптические срезы через определенные, предварительно заданные интервалы в режиме реального времени.

Визуализация живых тканей с помощью ЛСКМ гораздо сложнее, чем получение изображения связанных образцов, и не всегда возможна практически, поскольку образец может не выдержать условий наблюдения. В таблице 1 приведены некоторые факторы, которые необходимо учитывать при наблюдении живых и связанных клеток с помощью ЛСКМ. Некоторые образцы просто физически невозможно поместить на предметный столик микроскопа, или они не смогут оставаться живыми на нем в течении всего периода наблюдения. Исследуемое явление или структура могут не попадать в поле зрения объектива. Например, имагинальные диски крыла дрозофилы развиваются слишком глубоко в личинке, поэтому их невозможно наблюдать; а после препарирования, они не могут развиваться в культуре. Поэтому сегодня единственный доступный метод наблюдать экспрессию генов в тканях такого типа - рассечь личинку, связать и окрасить имагинальные диски, взятые из образцов на разных стадиях развития.

Табл. 1. Наблюдение связанных и живых клеток с помощью ЛСКМ

Успешное наблюдение и создание изображений живых клеток требует чрезвычайной осторожности в течение всего процесса, Обязательным условием является поддержание приемлемых условий на предметном столике микроскопа. Повреждения, наносимые клетке при облучении лазерным лучом, могут накапливаться при многократном сканировании, поэтому это воздействие должно быть сведено к минимуму, необходимому и достаточному для получения изображения. В культуральную среду обычно добавляются антиоксиданты, например аскорбиновая кислота, для сокращения кислорода, выделяемого при облучении флуоресцентных молекул светом возбуждения, и способствующего образованию свободных радикалов, убивающих клетки. Обычно необходимо проводить всесторонние предварительные контрольные опыты для оценки влияния облучения на флуоресцентно окрашенные клетки, внимательно следя за соответствием всех параметров изображения проводимому наблюдению. Вслед за пробными изображениями необходимо оценить жизнеспособность живых образцов. Эмбрионы, например, должны продолжать свое нормальное развитие в течение всего процесса наблюдения, поэтому необходимо выявлять любые аномалии, вызванные воздействием облучения или флуорохромами. На рисунке 2 представлена съемка в заданный временной интервал эмбриона дрозофилы, флуоресцентно окрашенного зеленым кальцием. Серия снимков показывает изменение распределения флуоресцентного свечения во времени.

Каждый тип клеток требует своих мер для поддержания их жизнеспособности в процессе наблюдения. Для некоторых клеток насекомых достаточно поддержания комнатной температуры и наличия достаточно большого объема подходящей среды. Однако, большинство типов клеток требуют подогрева предметного столика и, иногда, перфузионной камеры для поддержания необходимого баланса углекислоты в течение их нахождения на предметном столике. Выбор типа клеток, для которых условия наблюдения с помощью ЛСКМ наименее «враждебны», поможет избежать многих экспериментальных проблем. Усовершенствования современных конфокальных приборов привели к существенному сокращению потенциальных проблем. Повышенная квантовая эффективность, большая числовая апертура (яркость) объективов и использование менее токсичных красителей для клеток привели к тому, что конфокальная микроскопия стала практичным методом анализа живых клеток. Необходимо стремиться к использованию лазеров меньшей мощности, позволяющих, в то же самое время, выполнять регистрацию и обработку изображений как можно быстрее. Если для ускорения сбора и регистрации изображений увеличивается апертура точечной диафрагмы (по сравнению с наблюдением неживых образцов), то последующая деконволюция может иногда восстановить потерянное качество снимка.

Рис. 2. Съёмка в заданный временной интервал

Многие физиологические процессы и события протекают слишком быстро, и поэтому не могут быть захвачены большинством ЛСКМ, скорость визуализации которых в среднем один снимок в секунду. ЛСКМ, использующие акустооптические устройства и щелевые диафрагмы, быстрее возбуждаемых гальванометром точечных сканирующих систем и более практичны для физиологических исследований. Эти более быстрые установки соединяют хорошее пространственное и временное разрешение, которое может достигать 30 кадров в секунду при полноэкранном разрешении, или быть близким к скорости видео изображения. В более медленных микроскопах, со сканированием через точечное отверстие, временное разрешение может быть увеличено только за счет уменьшения области сканирования образца. Если необходимо полное пространственное разрешение, частота кадров должна быть уменьшена, что ведет к потере временного разрешения. Конфокальные системы, в которых применяются сканирование диском или колеблющимся зеркалом, также способны визуализировать быстрые физиологические процессы или другие скоротечные события.

Z-серия и трехмерные изображения

Z-серия - это последовательность оптических срезов образца, выполненных на разных уровнях в плоскости, перпендикулярной оптической оси (z-ось). Z-серии изображений получаются путем согласования пошаговых изменений в тонкой фокусировке микроскопа с последующим получением изображения на каждом шаге. Пошаговое перемещение фокуса обычно выполняется шаговым двигателем под управлением компьютера, который изменяет фокус на заданную величину. С помощью макропрограммы компьютера можно получить и сохранить изображение, перефокусировать микроскоп на заданную глубину в образце, получить и сохранить второе изображение, опять произвести рефокусировку в новой плоскости и так далее, пока не будет получено запрограммированное число изображений.

Нужные изображения могут быть взяты из z-серии, полученной при съемке выбранной области образца и обработаны специальной программой для последующего детального исследования определенных клеток, представляющих интерес. Z-серия может быть представлена как фотомонтаж изображений, как, например, на рисунке 3. Этот тип комбинации и отображения изображений, а также многие другие операции с изображениями, входит в стандартный набор свойств современных пакетов программного обеспечения по работе с изображениями. Снимки на рисунке 3 являются выборкой из большей серии с еще более частым шагом по оси z. Зеленое свечение определяет периферийную нервную систему эмбриона дрозофилы, окрашенного антителом 22C10.

Рис. 3. Z-серия оптических срезов

По сериям из нескольких сотен оптических срезов образца, произведенных ЛСКМ, может быть трудно составить представление обо всем комплексе взаимосвязанных структур. Тем не менее, z-серия, после регистрации, является идеальным материалом для последующего трехмерного представления образца с помощью методик объемной визуализации. Этот подход сейчас повсеместно используется для прояснения отношения между структурой и функцией тканей в медицине и биологии. Важно задать правильный шаг z-сканирования образца определяемый шагом двигателя, изменяющего фокус; в этом случае снимок будет отражать действительную глубину образца.

До тех пор, пока образец остается неподвижным при его наблюдении, снимки z-серии, произведенной ЛСКМ, будут превосходно зарегистрированы, а сохраненные в цифровом формате, они будут относительно легко преобразованы в трехмерное представление образца. На рисунке 4 сравнивается отдельный оптический срез (a) с проекцией z-серии (b) и иллюстрируется ценность этой методики при визуализации периферийной нервной системы эмбриона дрозофилы, меченного антителом 22C10.

Шаг шагового двигателя, устанавливаемый оператором микроскопа, связан с толщиной оптического среза, но может иметь другое значение. Толщина оптического среза привязана к толщине среза образца, наблюдаемого в микроскоп, и зависит от объектива и диаметра точечной диафрагмы. В некоторых случаях, тем не менее, шаг фокуса может совпадать с толщиной оптического среза, и это может приводить к путанице.

Вслед за получением файла z-серии, его отправляют на обработку программой трехмерной реконструкции, специально разработанную для обработки конфокальных изображений. Такие программы обладают чрезвычайным быстродействием при использовании на графических станциях, но могут быть успешно использованы и на персональном компьютере или графической станции самого конфокального микроскопа, при достаточно быстром процессоре и наличии большой оперативной памяти. С помощью этих программ можно создавать как отдельные трехмерные представления образца, так и последовательность представлений, сменяющих друг друга, составленных по разным видам образца, что производит эффект вращения или других пространственных трансформаций и дает лучшее восприятие трехмерных свойств образца. Программа позволяет варьировать длину, глубину, производить объемные измерения, а также интерактивно менять специальные параметры изображения, такие как прозрачность образца, для выделения различных структур в разных уровнях образца.

Рис. 4. Оптический срез и проекция z-серии

Другой способ представления серии оптических срезов, взятых из последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал - это трехмерное представление, в котором ось z имеет функцию временной оси. Этот подход полезен при визуализации физиологических изменений при развитии организма. Примером применения этого метода было прояснение динамики изменения концентрации кальция в процессе развития эмбрионов морского ежа. Цветовое кодирование оптических срезов, взятых на разной глубине - простой способ представления трехмерных данных. На практике, цвет (обычно красный, зеленый или синий) приписывается каждому оптическому срезу, полученному на разной глубине образца, а затем цветные изображения объединяются, и за счет изменения цветов с помощью программы обработки изображений достигается желаемый эффект.

Получение четырехмерных изображений

С помощью ЛКСМ, динамические явления, проявляющиеся в живых тканях или в процессе подготовки живых тканевых культур и отраженные в последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал, могут быть представлены в четырехмерном виде, со временем в качестве четвертого измерения. Z-серии, полученные через определенные интервалы, представляют собой четырехмерные наборы данных: три пространственных измерения (x, y и z) и время, в качестве четвертого, что можно наблюдать с помощью программы 4D просмотра. Такие программы позволяют составлять и проигрывать как кинофильм, стереопары, взятые в разные моменты времени, или, альтернативно, обрабатывать и представлять воссозданные трехмерные изображения, снятые в разные моменты времени, как смонтированный фильма.

X-Z изображения

Если необходимо получить вид образца сбоку, как, например, вертикальный разрез эпителиального слоя, можно произвести x-z сечение одним из двух способов. Вид сбоку можно получить сканированием по одной линии образца (ось x) с разной глубиной (ось z), контролируя шаговым двигателем изменение фокуса, а затем объединяя всю серию срезов в единое изображение. Другим методом является использование опции плоскость разреза в программе воссоздания трехмерных изображений, когда вид сбоку выделяется из существующей z-серии оптических срезов. При формировании изображения эпителия крыла бабочки на рисунке 5, лазер сканировал по одной линии (горизонтальная черная линия на левом снимке) проникая в образец при разных значениях z-координаты, или глубины. X-z изображение, представленное на рисунке 5, было построено и представлено конфокальной системой визуализации. Эпителий крыла состоит из двух эпителиальных слоев, но, поскольку интенсивность флуоресцентного свечения падает с увеличением глубины проникновения лазерного луча в образец, четко визуализирован только верхний слой.

Рис. 5. Изображение в X-Z плоскости

Создание изображения в отраженном свете

Все ранние конфокальные микроскопы работали в отраженном, или обратно рассеянном свете. Используя отраженный свет, многие образцы в конфокальной микроскопии можно наблюдать неокрашенными, либо они могут быть помечены красителями с высокой отражающей способностью, как, например, иммунозолотом или микрокристаллами галогенидов серебра. Преимущество наблюдений в отраженном свете, особенно для живых тканей, состоит в том, что образец не подвергается фотообесцвечиванию. Но красители некоторых типов могут ослаблять лазерный луч. Другой потенциальной проблемой является то, что в некоторых микроскопах могут возникать внутренние отражения от оптических элементов на оптическом пути луча. Для многолучевых версий ЛСКМ и ЛСКМ со щелевой диафрагмой проблемы отраженного света не существует, а в тех микроскопах, где она есть, применение поляризаторов, визуализация областей без артефактов и смещение от оптической оси, помогают уменьшить проблему.

Создание изображений в проходящем свете

Любой из режимов визуализации в проходящем свете, обычно применяемый в микроскопии, может быть использован в ЛСКМ, включая фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), темное поле или поляризованный свет. Свет, прошедший через образец попадает на приемник проходящего света, сигнал которого, через волоконно-оптически й световод, направляется в один из фотоумножителей в сканирующей головке микроскопа. Изображения в проходящем свете и конфокальные эпифлуоресцентные изображения могут захватываться одновременно при использовании одного и того же луча от осветителя, что гарантирует их точную регистрацию. При объединении или синтезе изображений с помощью соответствующего программного обеспечения, может быть отражено точное положение меченых клеток в ткани. В некоторых исследованиях предлагается следующий содержательный подход: объединить неконфокальное изображение в проходящем свете с одним или более конфокальных флуоресцентных изображений меченых клеток того же образца. Такой подход позволит, например, определить пространственные и временные аспекты миграции субпопуляции меченых клеток в пределах популяции немеченых клеток в течение нескольких часов или даже лет.

Сегодня уже широко используется цветной приемник проходящего света, который принимает проходящие сигналы в красном, зеленом и синем цвете (RGB) для создания цветного изображения в реальных цветах, подобно тому, как это делается в некоторых цифровых цветных фотоаппаратах. Такой приемник особенно полезен для патологоанатомов, которые обычно наблюдают реальные цвета в тканях в проходящем свете и накладывают эти изображения на флуоресцентные данные для анализа.